LER現(xiàn)象揭秘：細菌內(nèi)毒素檢測中的假陰性風(fēng)險與應(yīng)對措施

自2013年以來，“低內(nèi)毒素回收"（LER）現(xiàn)象在細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。LER描述了在含有螯合緩沖液和聚山梨醇酯的未稀釋單克隆抗體制劑中，觀察到的鱟試劑（LAL）檢測干擾（抑制）。這一現(xiàn)象引發(fā)了關(guān)于病患者安全和藥典細菌內(nèi)毒素測試在檢測生物制品中低水平內(nèi)毒素污染有效性方面的廣泛討論。

一、內(nèi)毒素與LPS的基本概念

在討論LER現(xiàn)象時，首先需要明確“內(nèi)毒素"和“脂多糖"（LPS）的概念。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的成分，而LPS是內(nèi)毒素復(fù)合物的特定成分，包括脂質(zhì)A部分，它會引起哺乳動物的致熱反應(yīng)，并在LAL測試中引發(fā)信號產(chǎn)生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質(zhì)A）嵌入細胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細胞外環(huán)境。

二、LER現(xiàn)象的生化與物理基礎(chǔ)

美國藥典（USP）內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和目前與LAL檢測試劑盒相關(guān)的所有市售內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸"LPS制劑。

在LAL試驗中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當(dāng)再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優(yōu)化LPS的聚集狀態(tài)以進行試驗。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會導(dǎo)致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態(tài)，進而降低其生物活性，出現(xiàn)LER現(xiàn)象。

三、LER現(xiàn)象對患者安全與藥典測試的影響

LER現(xiàn)象可能導(dǎo)致LAL檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對患者安全構(gòu)成隱患。然而，經(jīng)過改進的工藝控制加上有效的LAL檢測，在工藝過程和釋放檢測中都很好地保證了這些生物制劑的供應(yīng)安全。

此外，歐盟委員會（EC）和美國藥典（USP）的專家委員會也對LER現(xiàn)象進行了深入研究，并認(rèn)為當(dāng)前的藥典測試方法對于檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染是有效的。

四、LER現(xiàn)象的實驗研究與數(shù)據(jù)支持

多項實驗研究表明，LER現(xiàn)象并不是LAL測試有效性的問題，而是用作對照的加標(biāo)分析物的選擇以及保持時間研究的實驗設(shè)計的問題。

例如，在一項LER制劑保持時間研究中，同時進行了兔子熱原測試（RPT）和LAL檢測，并使用內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和各種實驗室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌）作為加標(biāo)分析物。在研究開始時（T=0），所有加標(biāo)制劑在RPT中產(chǎn)生類似熱原反應(yīng)，且在LAL試驗中完-全檢測到。在保持24小時后，囊泡制劑在RPT中仍有反應(yīng)，LAL檢測回收正常；但RSE在兔熱原試驗和LAL檢測中均無反應(yīng)，顯示了LER現(xiàn)象的存在。

此外，已發(fā)表的數(shù)據(jù)也表明，在適當(dāng)?shù)膶嶒灄l件下，使用天然內(nèi)毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應(yīng)。

五、總結(jié)

LER現(xiàn)象揭示了LPS和內(nèi)毒素雖然在化學(xué)、結(jié)構(gòu)和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應(yīng)。因此，在使用“內(nèi)毒素"一詞時，必須明確其含義。此外，針對LER現(xiàn)象的研究也促使USP提出了一種由天然內(nèi)毒素組成的新型“天然內(nèi)毒素"（NOE）標(biāo)準(zhǔn)制劑，以更好地模擬天然內(nèi)毒素污染的情況，并進一步提高LAL檢測的準(zhǔn)確性。

LER現(xiàn)象是一個復(fù)雜的問題，涉及多個方面的因素。然而，經(jīng)過深入研究和實踐驗證，當(dāng)前的LAL檢測方法在檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染方面仍然是有效的。未來，隨著對LER現(xiàn)象和NOE標(biāo)準(zhǔn)制劑的進一步研究，我們將有望進一步提高內(nèi)毒素檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。